- 吴陶;樊念;杨佳润;左真祯;陈燚垚;陈大福;郭睿;邱剑丰;
DNA甲基化在调节昆虫的生长发育、环境适应和免疫应答等生物学过程中发挥重要作用。但目前东方蜜蜂(Apis cerana)的DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的研究较为滞后，相关信息有限。本研究解析东方蜜蜂的DNA甲基转移酶1a(AcDNMT1a)和DNA甲基转移酶1b(AcDNMT1b)的理化性质和分子特征，并检测AcDnmt1a和AcDnmt1b在工蜂幼虫肠道发育及应答蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染过程中的表达模式，为深入开展AcDNMT1a和AcDNMT1b的分子功能和表观调控机制研究提供参考和依据。通过生物信息学预测AcDNMT1a和AcDNMT1b的理化性质、分子特征及系统进化，并比较东方蜜蜂与其他昆虫DNMT1a和DNMT1b所含的结构域和保守基序。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程及应答蜜蜂球囊菌侵染过程中AcDnmt1a和AcDnmt1b的相对表达量。AcDNMT1a和AcDNMT1b的蛋白质相对分子质量分别约为127.20 kDa和164.48 kDa,亲水性系数分别为-0.584和-0.544,均不含跨膜结构域与信号肽；AcDNMT1a可同时定位于细胞核、细胞质和线粒体，AcDNMT1b可同时定位于细胞核与细胞质。AcDNMT1a和AcDNMT1b的三级结构模板均为4wxx.1.A。AcDNMT1a和AcDNMT1b均含有5个功能结构域，包括DNMT1-RFD、 zf-CXXC、 BAH＿Dnmt1-I、 BAH和DNA＿methylase。东方蜜蜂与黑大蜜蜂(Apis laboriosa)和大蜜蜂(Apis dorsata)的DNMT1a在进化树上聚为一支；东方蜜蜂与黑大蜜蜂的DNMT1b在进化树上聚为一支。AcDNMT1a和AcDNMT1b具有相似的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络，与A0A2A3E789等10个蛋白形成互作网络。在幼虫发育过程中，AcDnmt1a和AcDnmt1b的表达量随日龄增长而降低，在6日龄幼虫中AcDnmt1a和AcDnmt1b的表达量较4日龄幼虫极显著下调。蜜蜂球囊菌接种后，AcDnmt1a的表达量在4～6日龄幼虫肠道中均下调表达；AcDnmt1b的表达量也在4～6日龄幼虫肠道中下调表达。AcDNMT1a和AcDNMT1b均为潜在的亲水性蛋白、非跨膜蛋白和胞内蛋白，主要分布在细胞核；东方蜜蜂和其他蜂的DNMT1具有较高的保守性；AcDnmt1a和AcDnmt1b在东方蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程中差异表达，并参与对蜜蜂球囊菌侵染的免疫应答。
2025年11期 v.44 1110-1120页 [查看摘要][在线阅读][下载 1191K] [下载次数：92 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 吕园梦;李晓悦;王悦;戴继鸿;韩林;葛文静;胥欣瑶;李霞;胡圣伟;李村院;
基因工程菌(genetically engineered bacteria, GEB)凭借其强大的生物合成能力，可高效生产功能多样的生物活性物质以提升动物生产效率。本研究旨在构建高效分泌外源蛋白的工程菌。采用有限稀释法并结合毒力基因鉴定、溶血实验和药敏实验从健康奶牛粪便中分离并筛选出潜在的底盘大肠杆菌(Escherichia coli)E28。通过引入透明质酸钠水解酶基因HGM117和信号肽pelB对低拷贝质粒pBAD进行改造，获得重组质粒pBAD-pelB-HGM117;分别将重组质粒转化至益生大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917, EcN)和候选底盘菌E28。利用SDS-PAGE证实了该质粒的胞外分泌表达能力，基于DNS法的酶活力测定结果表明新型工程菌E28分泌表达的蛋白酶活力显著高于EcN的。本研究成果为畜牧业生物制剂的开发提供了新的模式，同时为其他重要经济家畜底盘菌的开发提供参考。
2025年11期 v.44 1121-1135页 [查看摘要][在线阅读][下载 1206K] [下载次数：130 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 张喻嘉;王玉彤;肖星;张伟杰;杨帅;简纪常;王娜;庞欢瑛;
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)引发的弧菌病对水产养殖行业造成了重大威胁，为研究其耐药机制与蛋白翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)的关系，本研究鉴定了溶藻弧菌磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase, TPI)的N-ε-赖氨酸乙酰化、琥珀酰化、丙二酰化修饰，发现TPI蛋白PTMs及其表达量在溶藻弧菌野生株和耐药株间的差异。通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot, WB)测定溶藻弧菌野生株(HY9901)、氟苯尼考耐药株(FBNK)和恩诺沙星耐药株(ENSX)的tpiA基因相对表达量和蛋白表达量。通过WB鉴定TPI天然蛋白的N-ε-赖氨酸乙酰化、琥珀酰化、丙二酰化修饰并分析其与耐药的关系。RT-qPCR的结果显示，与HY9901相比，在FBNK中tpiA基因的mRNA表达量下调(P<0.01), ENSX中的则上调(P<0.01)。WB结果也证明，与HY9901相比，TPI蛋白在FBNK中的表达量下调，在ENSX中的表达量上调。进一步研究发现，HY9901、 ENSX和FBNK的TPI天然蛋白均具有乙酰化、琥珀酰化、丙二酰化修饰。与HY9901相比，ENSX、 FBNK中的TPI蛋白乙酰化水平降低但琥珀酰化水平升高；ENSX的TPI蛋白丙二酰化修饰水平升高，而FBNK的修饰水平降低。溶藻弧菌野生株和耐药菌株中tpiA的表达量与耐药相关，TPI天然蛋白的N-ε-赖氨酸乙酰化、琥珀酰化、丙二酰化修饰水平存在差异，表明这三种N-ε-赖氨酸修饰与溶藻弧菌的耐药有关。
2025年11期 v.44 1136-1146页 [查看摘要][在线阅读][下载 1024K] [下载次数：75 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 梁艳;李雪锋;李然;樊晓晖;梁莹;
本研究主要探讨Huh7细胞来源外囊泡(Huh7 cell-derived extracellular vesicles, Huh7-EVs)联合新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)对肝癌Huh7细胞生物学行为的协同抑制作用及潜在机制。通过饥饿预处理诱导Huh7细胞激活自噬，采用超速离心法和PEG6000沉淀法提取并鉴定其释放的Huh7-EVs;通过CCK-8法、划痕实验、 Transwell侵袭实验及克隆形成实验，评估NDV、 Huh7-EVs及其联合处理对Huh7细胞增殖、迁移、侵袭与克隆形成的影响；采用免疫荧光及免疫印迹检测自噬相关蛋白LC3B、 Beclin-1、 p62及JAK2/STAT3信号通路蛋白表达水平。饥饿预处理有效激活Huh7细胞自噬，获得高纯度EVs。Huh7-EVs与NDV联合应用较单独处理组更显著抑制Huh7细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成(P<0.05)。在机制上，联合处理可协同增强自噬相关蛋白LC3B、 Beclin-1表达，下调p62水平，并显著抑制JAK2/STAT3信号通路活性(P<0.001),提示其通过激活自噬通路和调控信号网络共同发挥抗肿瘤效应。综上，Huh7-EVs可协同增强NDV对肝癌细胞的抗肿瘤效应。Huh7-EVs联合NDV在体外可协同抑制肝癌细胞恶性行为，其机制可能与增强自噬活性及下调JAK2/STAT3信号通路有关。本研究为溶瘤病毒联合外囊泡治疗肝细胞癌提供了新思路和实验依据，具有潜在的临床转化价值。
2025年11期 v.44 1147-1156页 [查看摘要][在线阅读][下载 1143K] [下载次数：20 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 韦雅露;张玉雪;卿天钰;何金声;何榕晏;长孙东亭;罗素兰;
新型腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)血清型AAV-PHP.eB,可高效靶向中枢神经系统(central nervous system, CNS),是治疗CNS相关疾病的重要病毒载体。然而，采用三质粒瞬时转染法制备AAV-PHP.eB血清型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)的转染工艺参数仍缺乏系统探究。因此，本研究针对AAV-PHP.eB血清型病毒的三质粒瞬时转染包装条件，对其中的质粒总量与质粒-PEI Max比例进行优化，通过分析平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)以及利用流式细胞术检测荧光阳性细胞的比例，确定最佳转染条件为质粒总量4μg/孔、质粒-PEI Max比例为1∶3;应用最佳包装条件进行扩大生产制备的rAAV-PHP.eB-zsGreen1/tdTomato病毒粗液经qPCR检测滴度为7.94×10~9 vg/mL和7.09×10~9 vg/mL, SDS-PAGE证实病毒衣壳蛋白分子量符合预期理论值；通过观察荧光感染效果以及分析荧光面积占比，在体外对rAAV-PHP.eB病毒粗液感染能力进行评估，结果表明，两种病毒可有效感染AAV-293及多巴胺能神经元细胞(MES23.5细胞), PCR扩增验证了病毒感染MES23.5细胞后zsGreen1与tdTomato基因成功表达，进一步证明了rAAV-PHP.eB有效感染MES23.5细胞。本研究建立的优化包装体系与体外感染能力的验证，可为基于rAAV-PHP.eB,靶向CNS疾病(如帕金森病)开展基因治疗研究奠定基础。
2025年11期 v.44 1157-1170页 [查看摘要][在线阅读][下载 1252K] [下载次数：15 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 田婷婷;侯嘉;马珊妮;殷荷;田梅;党甜甜;赵志军;
近年来，国内外利用单细胞转录组测序技术对肺癌外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的研究较少，其基因表达谱的动态变化规律及其在肺癌发生发展中的调控作用尚未完全阐明。本研究创新性地运用此技术，通过细胞聚类、亚群注释、特征基因筛选、加权基因共表达网络调控分析、生存分析等方法，系统解析3例晚期非小细胞肺癌患者(疾病组)与1例健康男性(对照组)PBMC的特征基因及基因表达调控网络的差异。研究显示，肺癌患者均表现出细胞角蛋白19片段水平升高；单细胞测序数据分析共鉴定出14个细胞亚群，涵盖9种主要细胞类型；在基因表达调控网络分析中，研究发现疾病组CD4~+T细胞中的特征基因乳酸脱氢酶B和淋巴毒素B处于基因共表达网络调控中心，白细胞介素-7处于网络调控外周，提示这3个基因在细胞功能和免疫反应中可能具有重要作用。乳酸脱氢酶B、淋巴毒素B和白细胞介素-7与肺癌分期及预后具有相关性(P<0.05)。综合分析显示，肺癌患者PBMC各细胞亚群在基因表达上具有异质性，特别是CD4~+T细胞中的特征基因乳酸脱氢酶B、白细胞介素-7、淋巴毒素B显示出作为潜在生物标志物的价值，有望成为肺癌诊断、预后评估的新型生物标志物和潜在治疗靶点。这些发现不仅为深入理解肺癌免疫调控机制提供了新的见解，也为筛选新型肺癌标志物以及开发治疗靶点提供了重要的理论依据，具有重大的临床转化意义。
2025年11期 v.44 1171-1189页 [查看摘要][在线阅读][下载 1607K] [下载次数：233 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 吴红伟;吴翠红;魏立晓;陈红宁;顾志荣;石磊;
本研究旨在整合网络毒理学、多种机器学习算法与分子对接技术，系统性筛选并验证与马兜铃酸(aristolochic acids, AAs)暴露相关的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)核心生物标志物，并揭示其潜在的致癌分子机制。整合多个GEO公共数据集，经批次校正后筛选HCC的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)。通过ChEMBL、 SwissTargetPrediction及PharmMapper 3个互补数据库预测AAs潜在靶点。应用12种特征选择算法(包括Lasso、 Ridge、 Enet、 Stepglm、 SVM、 glmBoost、 LDA、 plsRglm、 RF、 GBM、 XGBoost和NaiveBayes)构建了113种算法组合，用于筛选最优模型，并对关键靶基因进行特征筛选，鉴定出最优诊断效能的核心基因组合。采用SHAP(shapley additive explanations)分析模型可解释性，并构建人工神经网络(artificial neural network, ANN)模型以验证核心标志物的分类效能。进一步通过CIBERSORT和ssGSEA算法分析核心基因与免疫微环境的关联。最后，采用分子对接技术验证靶点结合能。研究共获得68个AAs与HCC的共同靶基因，并对关键靶点进行基因本体论(gene ontology, GO)功能、基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。最优机器学习模型筛选出8个核心基因RND3、HMMR、LY6E、CCNA2、PCK1、PSPH、KIF11、TK1,其在HCC诊断中表现出较强潜力(AUC>0.85)。SHAP分析表明，RND3是模型中最重要的预测特征(SHAP value=0.164)。基于该基因组合构建的ANN模型展现出极高的分类效能(AUC=0.990, 95%CI:0.984～0.995)。免疫浸润分析表明，这些基因在调控免疫微环境中呈现两种相反的功能模式：部分基因(如HMMR、CCNA2)与免疫激活状态正相关，而另一部分(如RND3、PCK1)则与免疫静息或抑制状态正相关。分子对接结果证实了6个核心蛋白与AAs具有良好的结合活性。本研究成功鉴定出以RND3为代表的8个核心基因，可作为诊断AAs相关HCC的潜在工具。同时揭示了AAs可能通过直接结合关键蛋白，进而调控细胞代谢重编程和免疫微环境来诱导HCC的潜在分子机制。这些发现为阐明AAs的肝脏致癌机制提供了具体的分子靶点，并为HCC的早期诊断与精准治疗提供了潜在的生物标志物。后期相关研究应集中于对这些核心靶点进行体外与体内实验功能验证。
2025年11期 v.44 1190-1208页 [查看摘要][在线阅读][下载 1986K] [下载次数：746 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]