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高糖土壤微生物宏基因组文库的构建及β-葡萄糖苷酶基因鉴定
陆坚;杜丽琴;庞浩;马贵;韦宇拓;黄日波;采用宏基因组技术构建了高糖土壤微生物的DNA文库,该文库约含9万个克隆,文库外源DNA总容量为3.1×10~9bp。利用活性筛选策略,对文库进行筛选,获得11个β-葡萄糖苷酶的阳性克隆,并对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆和序列分析,获得两个编码新型β-葡萄糖苷酶的基因分别命名为:unbgl3A和unbgl3B。生物信息学分析表明:unbgl3A基因由2241个碱基对组成,unbgl3B基因由2292个碱基对组成。在核苷酸水平上,unbgl3A、unbgl3B与已知数据库中的β-葡萄糖苷酶基因没有任何相似性。在氨基酸水平上,与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的相似性分别为73%和69%。
CD138免疫磁珠细胞分选的FISH技术在多发性骨髓瘤诊断中的应用
钟明星;何程明;黄继薇;孟美丽;袁冬妹;邱道冲;张敬东;为了分析CD138免疫磁珠细胞分选的染色体荧光原位杂交(FISH)技术在提高多发性骨髓瘤(MM)细胞遗传学异常检测敏感性的作用。本研究选取我院收治的30例确诊MM的患者为研究对象,分离骨髓单个核细胞,应用探针组合,同时采用2种方法进行细胞遗传学检测:实验组采用CD138免疫磁珠分选浆细胞后行荧光原位杂交技术(MACS-FISH)检测;对照组直接荧光原位杂交技术(D-FISH)检测。结果:30例MM患者,实验组采用CD138 MACS-FISH检出率为83.3%,对照组D-FISH法细胞遗传异常检出率为46.7%,两组差异具有统计学意义(p<0.05)。研究结果表明:分析不同类型的细胞遗传异常,MACS-FISH法1q21检出率为46.7%,RB1检出率为50.0%,Ig H检出率为70.0%,P53检出率为20.0%;D-FISH法检出率分别为23.3%,30.0%、36.7%、10.0%。通过细胞核型分析,30例MM患者中,发现5例患者为异常核型,仅为16.7%,其中1例患者为单一结构异常,复杂异常核型患者为4例。我们的研究结论表明:进行CD138免疫磁珠分选浆细胞的FISH技术在多发性骨髓瘤诊断应用中可显著提高细胞遗传学异常检测敏感性,具有临床推广应用的价值。
基于转录组测序的硒处理银杏萜类合成的关键基因表达分析
余洁;肖贤;程华;查三省;罗延延;程水源;本研究以银杏叶品种(Ginkgo biloba L.)家佛手室内盆栽为试材,对3年生银杏幼苗进行亚硒酸钠叶面喷洒处理,并分析其萜内酯相关基因的表达变化。挖掘与萜类化合物合成相关基因并对其差异表达基因进行筛选和分析,研究结果表明,亚硒酸钠处理叶片转录组测序共获得142 834条Unigene,平均长度656 bp,基因差异表达(DEG)筛选得到5 292个基因,并将其进行KOG功能分类。通过对萜类化合物合成相关KEGG途径进行分析,筛选出6条候选基因。采用实时荧光定量(qRT-PCR)对选取的候选差异基因进行验证,其中DXS、MECT、HMGR上调表达,与转录组测序结果一致,而DXR、MECPs、MVD在转录组测序中虽无明显差异,但q RT-PCR结果表明其在硒处理后的5周内就有明显差异变化。本实验为银杏提供了较为全面的基因信息和代谢途径数据,为硒处理条件下银杏分子调控机制的深入研究奠定基础。
商陆不同极性、根和茎提取物的抑菌性能分析
赵国栋;王立宽;段静;毛丹瑱;刘雅;柳皓;孟凡君;为探究商陆不同极性、部位提取物的抑菌性能,本实验分别从商陆根和茎中提取石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相4种不同极性的提取物,再采用滤纸片法测量提取物对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyt-icus)4种细菌的抑制性能。结果表明,部分商陆的提取物有一定的抑菌活性,如根正丁醇相对巨大芽孢杆菌和副溶血弧菌,茎水相对副溶血弧菌的抑菌圈在10mm以上,但总体上商陆的提取物的抑菌性能远不及头孢氨苄好。实验还发现商陆抑菌活性最强的物质大都存在于根中,且抑菌活性最强的物质大都存在于水和正丁醇这种极性较高的溶剂的提取物中,不同提取物对不同细菌的抑菌活性情况不一致。因此本研究结果可以为商陆提取物抑菌性能的进一步探索提供参考。
枯草芽孢杆菌B25抗真菌作用及抗菌蛋白的分离纯化
于杰;张荣意;谭志琼;林宝英;枯草芽孢杆菌B25是对香蕉枯萎病镰刀菌有较好拮抗作用的一株生防菌。采用70%饱和(NH4)_2SO4沉淀法获得的B25的发酵液粗提物作用于病原菌,能使菌丝或孢子肿大、扭曲或畸形。粗提物质通过DEAE-Sepharose fast flow离子交换层析与Sephadex G-100凝胶层析进行分离纯化,经SDS-PAGE电泳检测得到了单一的条带,再通过Nano LC-ESI-MS/MS质谱分析,获得了17个肽段的氨基酸序列。NCBI数据库检索,与之序列相似性最高的仅为37%,可能是一种新的抗真菌蛋白。
多穗柯总黄酮对蟾蜍坐骨神经干动作电位的影响
向德标;李胜华;伍贤进;付军伟;为了研究多穗柯总黄酮对中华大蟾蜍坐骨神经干动作电位的影响,我们将离体中华大蟾蜍坐骨神经分为4组,分别置于浓度为0.01 g/L、0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L的多穗柯总黄酮溶液中浸泡,用BL-420S生物机能实验系统测定各组不同浸泡时间坐骨神经干动作电位的幅度、传导速度、阈强度及绝对不应期。随着多穗柯总黄酮溶液浓度增加和浸泡时间的延长,坐骨神经干动作电位的幅度升高(p<0.05或p<0.01),阈强度降低(p<0.01),绝对不应期缩短(p<0.05或p<0.01),传导速度加快(p<0.05)。因此,多穗柯总黄酮可增强神经的兴奋性,加速神经动作电位的传导。
市售椰子汁(植物蛋白饮料)中椰子、大豆、花生源性成分鉴定的分子生物学方法
杨硕;李诗瑶;王鸣秋;刘艳;徐芬;邵翠翠;张莉;史玉敏;胡冬立;为建立市售椰子汁饮料产品中目的种源成分(椰子)和非目的种源成分(大豆、花生)的分子生物学检测鉴定方法。本研究代表性抽取了6批次市售主流品牌椰子植物蛋白汁饮料,提取各样本DNA,通过扩增基因组ITSⅡ片段验证核酸提取效果。之后利用PCR方法检测了样本中椰子种源成分并同时比较了椰子的稳定持家基因eEF1-α和UBC10扩增效果(Xia et al., 2014),发现所有检测样本均可检出椰子成分,并且UBC1O基因更适用于椰子汁这类工业化产品的靶向扩增。另利用实时荧光PCR验证大豆、花生等的源性成分引物、探针特异性,发现6个种源间无交叉反应,无非特异性扩增曲线。在实际样本检测中,实时荧光PCR显示6份样本中无花生源性成分检出;3#和6#样本有大豆成分检出,Ct值分别为33.89和38.15,6#样本经重复实验分析无明显差异,表明在2份椰子汁中检出非目的种源—大豆。考虑到6#样本为弱阳性,故采用特异性、灵敏度更好的微滴式数字PCR (dd PCR)检测并验证前期结论,分析显示在实时荧光PCR中有扩增的2份样本中,3#样本检出大豆阳性微滴信号,6#则为阴性,其余4份样本dd PCR与实时荧光PCR一致,均为阴性。本次实验筛选了更适合扩增椰子植物蛋白饮料DNA的靶基因,建立了此类产品中2个种源鉴定的实时荧光PCR方法,并通过先进的dd PCR法对可疑结果进行验证的完整解决方案,最终避免了假阳性结论,判定这6份市售产品中有1份样本存在掺杂使假。这项工作为监管部门提供了有效的监管手段和技术支撑,将有助于进一步规范椰子汁市场和质量安全。
RNA干扰沉默三角帆蚌HcCA3基因对贝类矿化作用的影响
王芹;汪桂玲;陈亚;王雅昱;徐智诚;为探究三角帆蚌基质蛋白基因Hc CA3的功能,本研究根据Hc CA3基因的c DNA全长序列,设计并合成特定的干扰链(si RNA),将干扰链注射到三角帆蚌闭壳肌内,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测Hc CA3基因在外套膜不同部位即前端缘膜(amp)、后端缘膜(pmp)和中央膜(mc)的表达变化。在RNA干扰预实验中,筛选了三条目的基因干扰链,其中si RNA-Hc CA3-1干扰链干扰效果最好;同时筛选了4条阴性对照链,发现Hc CA3基因在注射不同的阴性对照链的各个组织中的表达均呈现不同程度的显著性下降,并没有筛选到合适的阴性对照链。在RNA干扰正式实验中,随着累计注射干扰链si RNA-Hc CA3-1,Hc CA3基因在前端缘膜和后端缘膜内出现了相似的表达特征,12 d出现了敲降作用(分别为对照组的28%和30%),Hc CA3基因在中央膜中表达从12 d开始显著下降(为对照组的84%),18 d为对照组的76%。本实验通过累积注射si RNAHc CA3-1,成功的抑制了Hc CA3基因在外套膜不同部位的表达,推测该基因参与了贝壳和珍珠的矿化,为进一步研究Hc CA3基因的功能提供了基础。
基于Cytb基因的NCBI数据库序列可靠性分析
黄娅琳;徐燕红;侯森林;顾翀实;本研究以常用于动物种属鉴定的Cytb基因位点为研究对象,利用所测得的30种盗猎案件中常见的野生动物Cytb基因部分片段序列及NCBI数据库中下载的该物种序列及其近缘物种序列,构建系统进化树。根据进化树的聚类情况,判断NCBI数据库中的相关基因序列或物种名称的正确性,并对其中错误序列的登陆号进行标记,以防对后续涉案动物的准确鉴定造成影响。分别从30种常见涉案野生动物(共35份样本)中提取线粒体DNA,并利用通用引物扩增线粒体DNA上的Cytb基因部分片段并进行测序分析。通过NCBI数据库的Blast比对功能,筛选出与本研究物种同源性由高到低的物种,并从NCBI基因数据库中下载此类近缘物种的Cytb基因序列共482条,利用MEGA软件构建该物种的系统进化树。比对发现NCBI中登录号为DQ246798、KP202269、AY286434等3个序列所对应物种拉丁名错误。登录号为AY509634、AJ131639、AM072747等5个序列所对应物种拉丁名可能存在疑问。NCBI数据库数据可靠性有待进一步验证,只能作为涉案物种鉴定的参考数据之一,可借助构建系统进化树等方法来确认其结果的准确性。
紫锥菊多倍体诱导与鉴定
肖艳;鲍美华;彭菲;李艳辉;本实验以紫锥菊愈伤组织上刚分化出的不定芽为材料,用不同浓度秋水仙素溶液对其进行诱导,确定最佳处理浓度和处理时间,并对诱导的多倍体与二倍体进行形态、显微、染色体及过氧化氢酶(CAT)活性的比较鉴定。结果表明:0.025%秋水仙素浓度处理24h的诱导效果最好,诱导率达42.85%;多倍体植株叶片肥厚、根粗壮,气孔面积极显著地大于二倍体植株,染色体数从24～28条不等,CAT平均酶活性是二倍体的2.1倍。