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杜仲EuFLC1基因克隆与生物信息学分析
高源隆;董旋;赵德刚;以杜仲(Eucommia ulmoides Olive)雄花花芽为材料,依靠实验室构建的杜仲转录组库,采用cDNA末端快速扩增法克隆了3'端包含完整开放阅读框的745bpcDNA序列。经3'RACE产物和转录组库中5'端序列拼接,获得全长为872bp的杜仲FLC的cDNA序列,编码86个氨基酸,命名为EuFLC1。生物信息学分析显示:EuFLC1蛋白分子量约为10.005 kD,理论等电点为10.47,为亲水性蛋白;存在3个可能的磷酸化位点、1个可能的核定位信号和1个可能的核输出信号;不存在跨膜螺旋和信号肽;蛋白二级结构中包含2个α螺旋和4个β折叠,无规卷曲连接α螺旋及β折叠;蛋白三级结构同源建模结果表明,EuFLC1蛋白包含2个互相垂直的α螺旋,α螺旋间有2个处于同一平面的β折叠,蛋白的N端和C端为无规卷曲并伸向整体结构的一侧;是含有MEF2_like型MADS-box结构域的MADS-Box基因。Blastp结果中,与EuFLC1同源性较高的序列有:葡萄的floweringlocus C、小粒种咖啡的MADS-box protein FLC subfamily、巨峰葡萄的flowering locus C-like MADS-box protein,因此认为EuFLC1是杜仲FLC基因。系统发育树表明杜仲与同属唇形类植物的小粒咖啡聚为一支,与APGⅢ分类系统的分类结果一致。该基因为首次从第三纪孑遗植物杜仲中克隆到的MADS-Box基因,为研究MADS-Box基因的演化的提供了一个重要材料,为研究杜仲开花时间的分子调控机制奠定了基础。
RNA病毒载体介导的植物基因组编辑研究进展
张燕;陈军;崔凯;吉万全;李停栋;基因组编辑技术在植物育种和功能基因研究中发挥重要作用，但限制基因组编辑在植物上应用的一个关键因素是遗传转化困难或效率较低。目前最常用的农杆菌(Agrobacterium)或基因枪介导植物遗传转化方法需要经过复杂的组织培养和再生的过程，并且在进行基因编辑时往往要先通过筛选获得转基因植株，然后再进行突变体鉴定。近年来，RNA病毒载体作为一种新兴的植物基因组编辑递送工具，在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等模式植物及小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)等作物中得到应用。RNA病毒诱导基因编辑(virus-induced genome editing, VIGE)技术是将CRISPR基因编辑元件插入到病毒基因组上，然后通过病毒感染导入植物细胞中，进而对植物目的基因进行靶向编辑。本文综述了RNA病毒载体在植物基因组编辑中的应用现状，重点讨论了基于CRISPR/Cas9的RNA病毒载体介导的编辑技术，并分析了无组织培养型和组织培养依赖型技术的异同。本文还探讨了RNA病毒载体技术的优势与挑战，包括其在不同植物物种中的转化效率、编辑精准性及稳定性等问题。最后，本文展望了RNA病毒载体在未来植物基因组编辑中的应用前景。
皂苷的结构、活性及其在水产养殖中的应用
周俊宇;杨志刚;魏帮鸿;皂苷是由皂苷元和糖链两部分组成的化合物,根据苷元不同可分为三萜皂苷或甾体皂苷。苷元为三萜化合物的是三萜皂苷,苷元为螺旋甾烷化合物的是甾体皂苷。皂苷在自然界中的分布极为广泛,主要存在于陆生高等植物中。其中三萜皂苷主要分布于豆科、五加科、远志科等植物中。甾体皂苷主要存在于薯蓣科、百合科、玄参科等植物中。人参、黄芪、柴胡、麦冬、三七、知母等中药以及大豆、花生中都含有皂苷。除此之外,在海星、海参等海洋生物中也存在皂苷。现代药理学研究表明,皂苷具有许多重要的生物活性和药理作用,如增强机体免疫力、降低胆固醇、降血糖、溶血、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗炎、抗过敏、防治心血管疾病、治疗白血病等。在水产养殖中,皂苷作为清塘药物,常用于毒鱼、灭螺。在水产饲料中,皂苷常作为抗营养因子而被大量研究。然而,随着研究的深入,研究人员发现,皂苷作为一种饲料添加剂或药物佐剂,能够提高养殖动物的生长性能,增强养殖动物的免疫能力。本综述介绍了皂苷的结构和分类,同时介绍了皂苷的生物学功能,总结了皂苷对水产动物的影响,探讨了皂苷在水产养殖中的应用及其发展前景。
金钗石斛养胃保健口服液的工艺优化及功效学分析
吴倩男;杨彬艳;陈晓兰;余兰;许朋;为优化金钗石斛养胃保健口服液制备工艺,并初步探索口服液对胃粘膜的保护作用,本研究以口服液中多糖、党参炔苷、石斛碱的相对含量作为考察指标,通过单因素考察及正交设计法优化口服液的制备工艺,采用急性胃粘膜损伤酒精模型对金钗石斛养胃保健口服液进行功效学研究。结果显示,金钗石斛养胃保健口服液的配方为金钗石斛8 g、党参32 g、黄芪32 g、白术12 g、麦冬10 g、北沙参10 g、山楂10 g,可修复胃粘膜损伤。正交设计优化口服液的制备工艺结果为:加水量为15倍,提取时间为30 min,提取次数为3次。由此得出结论,优化后的口服液制备工艺可行、可靠;通过药效学实验,证明选定的配方具有明显的胃粘膜保护作用。本研究将得出金钗石斛养胃保健口服液的最优化制备工艺,并能确定口服液保护胃粘膜的功效。
铜绿假单胞菌耐热亮氨酸氨肽酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及表达产物的酶学特性鉴定
李进;李青云;刘幽燕;陆柳萃;白雪;唐爱星;氨肽酶在食品加工、饲料生产、生物活性肽制备等多个领域被广泛应用，尤其是耐热氨肽酶的应用前景更加广阔。目前，有关铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)耐热氨肽酶基因的成功克隆和表达的研究较少，本研究将源自铜绿假单胞菌GF31的亮氨酸氨肽酶基因aps进行密码子优化，通过全基因合成得到aps序列并构建周质表达载体pET22b(+)-pelB-aps,在大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta gami2(DE3)中进行表达。纯化后的重组菌所产亮氨酸氨肽酶比活力为6.8 U/mg,最适反应温度和pH值分别为80℃和8.0;在50℃～70℃或pH 7.0～9.0下孵育1 h后该酶仍保持80%以上的活力；Co2+对其酶活力有较强激活作用，Fe2+、 Ni2+、 Zn2+、 β-巯基乙醇、 DTT、 EDTA、 1,10-邻菲咯啉和Bestatin对其有较强的抑制作用；该酶对Leu-pNA和Met-pNA的水解效果较好，对Ala-pNA和Arg-pNA也有一定水解能力，其中对Leu-pNA水解的Km和Vmax分别为1.11 mmol/L和101.01μmol·L-1·min-1。通过三维结构分析发现该酶由PA结构域与催化结构域组成，分子对接显示了关键氨基酸GLU305、 GLU304、 ASP272、 ASP333和ARG386与底物通过氢键结合，并在反应过程中有重要作用。研究结果为发掘铜绿假单胞菌GF31亮氨酸氨肽酶的应用价值、结构特征及定向改造提供了有价值的参考。
反硝化基因工程菌株YP4S的构建及对污水除氮特性研究
曾梅;涂玉佩;周锡梅;詹福建;黄铭辉;刘励杰;巫光宏;从养殖场污泥中筛选出菌株YP4,经16S rDNA分子发育树的同源序列比对,确定为克雷伯什菌属(Klebsiella sp.)。由NCBI数据库查编码亚硝酸还原酶(Nir)的基因nirS序列,设计引物,以铜绿假单胞菌PAOI基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增目的片段nirS,经过双酶切、克隆和转化,得到重组质粒pYP4S,然后转化野生菌株YP4,构建反硝化基因工程菌YP4S。菌株生长曲线测定表明,工程菌株YP4S与YP4的生长特性基本一致。工程菌株YP4S对模拟污水COD、TN、NH4~+-N和NO3~--N具有较高的去除率,YP4S与YP4相比,对NO2~--N积累的减少量为(32.44±3.96)%,明显减少了NO2~--N的积累。通过正交试验获得工程菌株YP4S在C/N=10、T=30℃、r=200 r/min和pH=7.0的最佳组合条件下,对模拟污水TN去除率较高。应用工程菌株YP4S处理猪场沉淀池的实际污水,COD、TN、TP、NH4~+-N和NO3~--N去除率分别为(95.87±0.82)%、(76.38±3.84)%、(97.13±0.54)%和(75.35±2.57)%,NO2~--N积累量为(3.31±1.24) mg/L,表明工程菌株YP4S具有较好反硝化作用,对含氮量高的实际污水修复具有潜在的应用前景。
转gfp基因大麦中gfp基因表达的半定量RT-PCR方法分析
苏琰;李融;陈建民;本研究以5种转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦的不同株系(A,B,C,D,F)及野生型Igri为材料,对供试材料的叶片中gfp基因的荧光表达量利用荧光显微镜测定,并对各株系进行半定量RT-PCR分析。研究结果表明:5种转基因大麦叶片的gfp基因荧光表达量不同,检测结果为F>A≈B≈C>D;同一转基因材料(C、F)的gfp基因表达存在组织差异,其花粉、叶片及根尖等不同器官中的gfp表达强度不同;转gfp基因D系的gfp基因沉默是gfp基因在转录水平失活。
基于细菌人工染色体的大基因质粒制备及应用研究
游小燕;吴梦;刘雪芹;何琦琳;范骁玲;细菌人工染色体(BAC)最多可克隆300 kb的DNA片段且遗传特性稳定,是目前常用的克隆载体。但如何高效提取BAC装载的大基因及其大基因操作等方面还需不断的摸索完善。本研究采用超大基因质粒提取法从BAC中提取出165 kb的大基因,经Nanodrop测定浓度、酶切、脉冲场电泳,表明获得目标基因;将获得的大基因质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经抗性筛选,获得细胞克隆;克隆细胞经PCR检测,证明大基因质粒被完整地导入猪胎儿成纤维细胞。本研究为构建细菌人工染色体提够基础数据。
贵州喀斯特地区具ACC脱氨酶活性细菌的分离和鉴定
李玲;沈琼雯;庞祥宇;王倩;韦植元;曹迅;邓年方;李有志;1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶能够降解乙烯前体,从而有助于植物生长。具有ACC脱氨酶活性细菌在旱胁迫下具有植物促生作用。本研究从贵州地区选取典型喀斯特地貌区域159份土壤样品中分离并鉴定出具有ACC脱氨酶活性的细菌188株。利用16S r DNA测序分析将这些菌株归为14属63种,优势菌属为假单胞菌属和伯克氏菌属,分别有ACC脱氨酶活性的细菌18种和17种。对63种菌株的ACC脱氨酶活性定量检测,酶活最高的菌株是AL30ADF120(Cupriavidus oxalaticus),为3.639 U/mg。据我们所知,这是第一个有关喀斯特地区土壤中的具有ACC脱氨酶活性细菌名录,为将来研究ACC脱氨酶活性细菌的植物促生作用奠定了基础。
人工养殖鲟鱼生长与肌肉品质的研究进展
张润锋;余翔;万年春;任华;孙宏懋;林亚秋;蓝泽桥;鲟鱼肉和卵极具营养价值,鲟鱼养殖规模稳定扩大,中国已经成为世界上最大的鲟鱼养殖国家。尽管国内外在鲟鱼保护生物学和应用技术方面取得了一系列科研成果,但对养殖鲟鱼的生长和肌肉品质的发育规律所知甚少。本文综述了国内外养殖鲟鱼异速生长模式和肌肉品质分析的研究现状,发现现有鲟鱼生长于肌肉品质的研究主要集中于幼鱼或某一个生长期,缺少系统性和完整性。因此,建议针对主要养殖鲟鱼品种,从幼鱼到成鱼系统开展养殖鲟鱼生长与肌肉品质变化规律的研究,揭示鲟鱼肌肉品质的生长发育规律。