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基于松墨天牛漆酶Laccase 2基因的RNAi体系优化
盛亮菁;翁明清;翁小倩;郭雅洁;张飞萍;吴松青;松墨天牛(Monochamus alternatus)是松材线虫病的主要传播媒介。建立高效的RNAi体系将有助于松墨天牛功能基因组的研究。本研究设计了松墨天牛Laccase 2基因的RNAi位点，分别利用体外转录和化学合成制备dsRNA和siRNA,并对其注射条件和注射龄期进行优化，结合表型观察和RT-qPCR验证RNAi沉默效果。结果表明，注射1μg和10μg dsRNA的蛹均出现羽化后畸形，无色素沉着且无法进行正常活动，而注射4μg siRNA的松墨天牛与对照组无明显差异。RT-qPCR表达分析发现，Laccase 2在蛹期到成虫期的表达量较高，老熟蛹中达到最高。对松墨天牛第1天的蛹注射dsRNA后，其Laccase 2的表达受到显著抑制，沉默效率可达70%左右。利用Laccase 2基因的dsRNA对松墨天牛中靶基因的表达量进行抑制，在蛹期注射1μg即可达到理想沉默效果，而siRNA注射在松墨天牛中没有效果。本研究结果为进一步基于功能基因组学开展研究提供技术支持，为松墨天牛生物防治提供新的方向。
产纤维素酶大肠杆菌工程菌的构建和酶的表达
陈小玲;芦志龙;吴仁智;陈英;黄俊;陆琦;陈东;为了使大肠杆菌(Escherichia coli)具备生产纤维素酶的能力,从铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PKC-001克隆碱性纤维素酶基因,进行密码子优化后连到载体pET-22b,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,对工程菌进行表达优化并分析纤维素酶酶活。结果表明大肠杆菌工程菌能生产分子量约39 kD的纤维素酶,在培养温度20℃、摇床转速170 r/min、IPTG终浓度0.01 mmol/L的条件下,纤维素酶的产量最大;在酸性条件下,细胞内和细胞外的滤纸酶活力(FPA)分别为5.78 U/mL和1.13 U/mL,在碱性条件下检测不到滤纸酶活。显然,重组纤维素酶仅在酸性条件下有活力。
七里香蔷薇叶绿体基因组测序及结构分析
杨芳;七里香蔷薇是蔷薇属木香花的一个变种,在秦岭山区广泛分布,具有重要的观赏价值,同时也是蔷薇属花卉育种的重要种质资源。本研究首次以秦巴山区七里香蔷薇为实验材料,采用Illumina HiSeq4000测序系统对其叶绿体基因组DNA建库测序,建库类型为350 bp DNA小片段文库,测序深度为59×。分析其基因组结构,并且与已报道蔷薇科植物叶绿体基因组进行比较。七里香蔷薇叶绿体基因组序列全长156 544 bp,具有典型被子植物叶绿体基因组环状四分体结构。叶绿体基因组包括大单拷贝区85 678 bp、小单拷贝区18 782 bp和2个反向重复序列26 042 bp。GC含量为37.22%;检测到116个串联重复序列43个散在重复序列;此外,还检测到72个简单重复序列位点。对其功能基因比对分析,该植物的叶绿体基因组共注释得到129个基因,包括86蛋白编码基因、35个tRNA基因和8个rRNA基因。用MEGA6.0软件通过邻近法基于叶绿体全基因组序列对所有已知叶绿体基因组的蔷薇科22个物种进行聚类分析,其与七里香蔷薇和大花香水月季、缫丝花聚在一起。研究结果对于七里香蔷薇野生植物资源的育种及引种驯化具有参考依据。
基于RAPD技术鉴定广地龙
黄庆;黄海涛;马志国;夏传国;李荷;毛润乾;本研究旨在建立起新的分子鉴定技术以应用于中药材市场上广地龙商品的鉴定。本研究收集广地龙及其混淆品种共5个品种，提取样品DNA，使用20个随机引物进行PCR-RAPD反应，筛选出扩增条带清晰、重复性好、多态性良好及反应程序稳定的引物用于广地龙及其混淆品种的鉴定。结果表明，最终筛选出3条引物可作为广地龙与其混淆品种的鉴别引物，分别为：引物DL05 (5'-CATCCCCCTG-3')，得到大小约为750 bp和1 000 bp的特异性条带；引物DL12 (5'-TGAGCCTCAC-3')，得到大小约为300 bp和500 bp的特异性条带；引物DL18 (5'-TTCCGAACCC-3')，得到大小约为1 000 bp和1 800 bp的特异性条带。选用DL12作为扩增引物，对体系中Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度及Taq DNA聚合酶浓度进行单因素条件优化反应体系，得到最佳的RAPD反应条件：Mg2+浓度为1.0 mmol/L,dNTPs浓度为0.2 mmol/L，引物浓度为0.3μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为1.5 U。本研究使用的RAPD技术操作简单可靠，可应用于市场上广地龙及其混淆品种的鉴定，为广地龙的鉴定研究提供了科学依据。
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长春花生物碱合成途径相关基因表达丰度与MeJA处理后基因表达差异分析
曾俊岚;刘万宏;廖志华;刘小强;长春花(Catharanthus roseus)中含有丰富的次生代谢产物,可产生130多种萜类吲哚生物碱,包括目前临床应用最广的天然植物抗癌药物长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine)。长春花萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids,TIAs)合成途径包括在内韧皮部相关薄壁细胞、上皮细胞、异细胞和乳管细胞等多种组织细胞内进行的20多步酶促反应。本研究选取TIAs途径上的CPR、LAMT、SLS、STR、SGD、TDC、16-OMT、T16H、D4H等9个酶基因,基于长春花转录组数据库,分析其在各组织器官和MeJA处理下的无菌苗、毛状根和悬浮细胞中的数字表达谱,找出其中可能对MeJA信号响应的基因。本研究发现,MeJA处理后,长春花无菌苗中以上9个基因表达量均发生上调;毛状根中除了TDC,另外8个基因表达丰度均为上调;悬浮细胞中除了D4H,另外8个基因表达丰度均上调。对整个转录组数据进行分析,发现经过MeJA处理后,仅有673条Unigene能在无菌苗、毛状根和悬浮细胞中均表现出差异表达,说明无菌苗、毛状根和悬浮细胞的MeJA应答机制存在较大不同。对这些能在3种体系中均发生差异表达的基因进行功能分类,主要包括初生代谢相关蛋白、次生代谢相关蛋白、植物激素相关蛋白、矿质离子结合蛋白、转运蛋白、信号转导相关蛋白、细胞壁合成与降解相关蛋白、转录因子、植物逆境响应蛋白9个方面。本研究可为通过外源因子调控长春花生物碱的生物合成提供参考。
羊乳“人源化”改造的两大利器——TALEN和CRISPR/Cas9的应用研究进展
宋绍征;张婷;陆睿;成勇;周鸣鸣;羊乳是一种理想的牛乳过敏症患者的替代乳品,TALEN和CRISPR/Cas9基因编辑技术是羊乳"人源化"改造的两大利器,能够与核酸内切酶相结合,特异性识别并结合生物体基因位点,切割DNA双链,导致双链断裂。通过同源重组(homologous recombination, HR)或非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ),可以对哺乳动物乳蛋白基因或其他生物体基因组进行定向精确修饰,具有简单、高效、精准、定向等特点,是近年来一种新兴的生物技术,被广泛应用于基因工程、动植物遗传育种及其他生物医学各领域。但在羊乳"人源化"改造中的应用综述研究尚未见报道,故本文主要对这两种基因编辑技术的基本结构与作用机理、发展历史、羊乳基因编辑研究进展、本课题组研究现状及展望进行综述,以期为相关研究提供参考。
高盐极端环境土壤基因组DNA的分离纯化方法研究及基因文库的构建
孙栋;唐莉丽;王倩倩;杨冬梅;蒋承建;武波;以钦州市犀牛角镇晒盐池内(盐浓度>25%)的土壤样品为研究对象,对土壤混合基因组DNA的提取和纯化方法进行了深入研究,结果表明,冻融法、十二烷基磺酸钠(SDS)和蛋白酶K联合使用的提取法,能有效提高DNA得率,DNA的产量达到每克土壤样品10~15μg。交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、Sephadex G-200树脂以及大量胶回收的使用,可有效纯化DNA,纯化的DNA产量可达每克土壤样品46μg,DNA片段大小>30 kb。将纯化的DNA用B amHⅠ部分酶切后构建以pLAFR 3为载体的混合基因组文库,该文库包含15 600个克隆,外源片段DNA平均大小为18 kb。通过DNA序列测定和同源性比较,对从文库中随机挑取的10个克隆进行了序列分析,发现9个外源插入片段包含未知DNA序列。
丝状真菌全局性调控因子LaeA的研究进展
王亚萍;谭玉梅;周国庆;兰亚;刘永翔;罗钊;刘作易;全局调控因子在丝状真菌次级代谢调控及其生长发育过程中有着重要作用。LaeA是2004年首次被发现的丝状真菌全局性调控因子。本综述介绍了LaeA在丝状真菌发育、次级代谢中的功能及其作用机制,总结了丝状真菌中已发现的laeA的同源基因,并对存在的问题及应用前景进行讨论与展望。
高粱基因组学研究进展
王海莲;管延安;张华文;杨延兵;秦岭;高粱是世界上主要的谷物作物之一,是越来越重要的生物燃料作物,是恶性杂草约翰逊草的祖先,同时也是很多具有复杂基因组的热带禾本科植物的植物学模型。因此高粱成为植物基因组学研究的主要对象之一。高粱基因组学研究的丰富历史随着重要的自交系材料BT×623全基因组测序的完成而达到顶峰,这为更好研究高粱基因及其相关功能打下了基础。对甘蔗亚族谷类植物以外的植物的更进一步的基因组特征分析,将有利于发现基因组大小和结构进化的机制,水平和模式,为进一步研究甘蔗和其它重要的经济作物奠定基础。
基于GEO数据库、TMT蛋白组学筛选绞股蓝对膀胱癌的蛋白靶点
常拓;齐彦爽;蔺曼;朴香兰;绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)是传统的中药材,对于多种癌症具有显著的疗效。为筛选绞股蓝对膀胱癌的作用靶点,本研究将30只SPF级SD大鼠随机分为模型组、给药组和空白组,通过膀胱灌注N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)建立膀胱癌模型并通过相同的方式进行膀胱灌注绞股蓝干预治疗,在第10周进行取材,通过H&E染色病理切片观察各组膀胱内肿瘤情况以明确药效。通过蛋白质组学串联质谱标签(TMT) 10重标记法检测各组膀胱组织的蛋白差异表达情况,结合GEO数据库中3组膀胱癌数据集对作用靶点进行筛选。结果显示,绞股蓝反向调节膀胱癌335种蛋白质,其中包括55种上调和280种下调。GEO的3个膀胱癌表达谱中汇集的差异蛋白(DEGs)包含20种上调和50种下调。将GEO中DEGs与TMT蛋白质组学中膀胱癌趋势相同的蛋白进行汇集,结合绞股蓝反向调节数据,总共筛选获得了3个反向调节靶点,其中包括1种下调的靶点CNN1和2种上调的靶点KRT19、PCP4,并通过蛋白免疫印迹法进行验证。本研究结果表明,CNN1、KRT19和PCP4可能是绞股蓝治疗膀胱癌的潜在靶点,绞股蓝可能通过调节CNN1、KRT19和PCP4来抵抗膀胱癌,这为绞股蓝治疗膀胱癌提供分子机制依据。